多重病原菌檢測是一種先進的診斷技術(shù)，它能夠同時檢測和識別多種病原體，包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲等。這種檢測方法在感染性疾病的診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，特別是在病原體多樣且復雜的情況下，能夠快速準確地確定病原體，從而制定有效的治療方案。

病原宏基因組高通量測序技術(shù)（mNGS）作為一種新型的基因水平檢測技術(shù)，無需預(yù)設(shè)、無需培養(yǎng)、無偏好性，能夠全面檢測標本中的所原體遺傳物質(zhì)（包括DNA和RNA），并進行高通量測序。基于生物信息學算法，該技術(shù)可以與病原數(shù)據(jù)庫進行比對分析，鑒定樣本中病原微生物的種類及功能信息，為臨床抗感染提供精準的病原學證據(jù)。

為了規(guī)范病原宏基因組高通量測序技術(shù)在臨床本地化檢測中的應(yīng)用，中國藥師協(xié)會、中華醫(yī)學會細菌感染與耐藥防治分會、國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點研究和標準制定專家委員會等機構(gòu)，于2024年1月在《中華預(yù)防醫(yī)學雜志》聯(lián)合發(fā)表了《病原宏基因組高通量測序臨床本地化檢測規(guī)范專家共識》。該共識在實驗室符合國家相關(guān)政策法規(guī)以及保證檢測方法性能可靠的前提下，對如何在本地開展mNGS檢測提出了具體指導意見。

干實驗的性能確認

當生物信息學分析流程建立后，需對其進行性能確認，可以通過三類數(shù)據(jù)集進行：（1）臨床標本測序數(shù)據(jù)集：注釋充分、特征明確的臨床標本測序數(shù)據(jù)（FASTQ或其他格式）；（2）計算機模擬測序數(shù)據(jù)：利用序列模擬軟件模擬生成測序數(shù)據(jù)集，要求既要具有與真實測序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)（文庫片段長度分布、測序模式、測序錯誤類型及頻率、測序質(zhì)量值、測序深度等），也要盡可能對臨床標本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進行模擬；（3）組合數(shù)據(jù)集：利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標病原體的測序數(shù)據(jù)，然后將模擬序列添加到目標病原體陰性標本的真實測序數(shù)據(jù)中，形成接近臨床標本的模擬數(shù)據(jù)集。利用上述數(shù)據(jù)開展性能確認，確定干實驗流程的主要性能指標，包括準確率、精確率、召回率和 F1-Score（即精確度和召回率的調(diào)和平均值）等。如果在比對過程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽性結(jié)果（寄生蟲為真核生物，與宿主序列相似度較高，且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染），需要考慮設(shè)置更高的陽性匯報閾值或者對相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進行清洗。常見的寄生蟲匯報閾值為與陰性對照相比RPM 達到 10 倍以上，基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標寄生蟲基因組單獨與人基因組比對并去除高度同源的序列。

全流程的性能確認

確認 mNGS 濕實驗和干實驗全流程對病原體的檢測能力是否能夠達到臨床預(yù)期用途。在全流程性能確認中至少應(yīng)包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌、絲狀真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA病毒、寄生蟲，同時應(yīng)關(guān)注胞內(nèi)菌和難破壁的病原微生物。

性能確認參數(shù)可參考《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》、《臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗證》、《病原宏基因組高通量測序性能確認方案》等，建議實驗室 mNGS 檢測系統(tǒng)應(yīng)對方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準確度、檢出限、抗干擾能力（如針對高人源標本）、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進行確認。

樣品盤的制備

樣品盤要包含模擬參考品和已知病原檢測結(jié)果的真實臨床標本。樣品盤的設(shè)置應(yīng)嚴格遵循臨床預(yù)期用途所涉及的標本類型，所含微生物應(yīng)有代表性，盡可能覆蓋預(yù)期用途中的病原體。標準微生物菌株可以選用ATCC或CMCC菌株等。應(yīng)根據(jù)不同標本類型來合理地設(shè)置模擬參考品中的人源細胞濃度（如支氣管肺泡灌洗液的人源細胞濃度中位數(shù)為 10⁵cells/ml）。模擬參考品中應(yīng)至少包含革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌、酵母菌、分枝桿菌、DNA 病毒、RNA 病毒、寄生蟲共 8 類病原微生物。在制備模擬參考品前，針對所有待投入微生物進行檢出限（limit of detection， LoD）研究并確認是否能滿足預(yù)期用途中對檢測性能的要求。

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